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血液筛查新技术——核酸检测

作者:血站信息科   添加时间:2014-04-14 10:51:02   浏览:

 血清学酶联免疫吸附法(ELISA)检测技术作为国家法定的血液筛查标准方法,在检测输血相关传染性疾病中发挥着重要作用,但相比日渐成熟的核酸检测技术,相对存在较长的窗口期。血液NAT检测新技术的应用将为进一步提高血液安全提供支持。
    目前血液中乙型肝炎、丙型肝炎病毒以及艾滋病病毒检测用ELISA方法检测HBsAg,anti-HIV,anti-HCV,窗口期分别为45—56天、22天、72天。实际情况又与个体情况不同而有差异。所谓窗口期,指献血者从感染病原体开始,直至用某种检测方法检测到该病原存在为止的时间段,也就是说在该病毒窗口期时,是检测不出该病毒存在。在单用ELISA技术的条件下,国外已有不少新发输血后感染的报道。除了窗口期漏检外、免疫静默感染(immuno silentinfection)以及罕见病毒的亚型与变异也会导致常规血清学漏检。
    NAT是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称,其基本步骤包括核酸提取、扩增和检测。其检测敏感性高,可检出血样本中极微量核酸,在病毒感染后数日即可检出,从而大大缩短病原体检测窗口期。进一步减少输血所引发的疾病传播的可能性。有研究表明,NAT检测可将HBVHIVHCV感染的平均窗口期分别缩短至9 天、11天和13 天。此外NAT检测还可检出病毒变异,免疫静默感染等因素所致漏检的感染献血源。
    目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩增技术主要为聚合酶链式反应(PCR)技术和转录介导的扩增方法(TMA)技术。
    PCR
技术原理为:按照模板DNA序列,在DNA聚合酶的催化下,用4dNTP来合成与模板DNA完全相同的拷贝,从而在多种DNA分子混合物中特异扩增某一特定的DNA片段,然后可通过各种方法分析扩增产物。如在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线,当荧光信号出现由本底进入指数增长阶段的拐点即达到荧光域值即为阳性,反之为阴性。运用该项技术,我们可以通过标准曲线对DNA RNA样品进行定量分析。
    TMA
技术则是一种转录扩增的过程,它使用两种酶,逆转录酶和RNA聚合酶,在酶催化下复制出上亿的RNA序列拷贝。包括三个主要步骤:首先是目标捕获,用洗涤剂破坏病毒包膜或衣壳,使RNADNA释放,从而捕获寡核苷酸结合于病毒核酸(至少2个保守区域)和内标分子(IC)上,然后结合于磁性微粒的互补序列。第二步,扩增,它使用两种酶,即MMLV逆转录酶和RNA聚合酶。逆转录酶用于产生一个具有目标序列的DNA拷贝(含有RNA聚合酶的一个启动子序列),然后以DNA拷贝为模板,通过RNA聚合酶催化生成多个RNA扩增子的拷贝。最后进入第三步,检测,即通过标记有化学发光分子的检测探针,对扩增后的病毒核酸片段进行特异性检测,分别检测内标分子信号和病毒核酸信号,随后检测系统软件自动对结果进行分析,并报告样品检测结果。
    NAT 20 世纪90 年代末开始, 逐步应用于献血者血液病毒感染筛查能够降低输血传播病毒的残余危险度50% 以上。目前,欧美等一些发达国家和地区已经将NAT 常规用于血液的筛查, 在降低输血传播病毒风险方面取得良好的效果。
     NAT
检测与ELISA检测在方法学上各具特色,NAT检测基本不受ELISA检测制约因素的影响,因而两种检测技术存在良好的技术互补性。将核酸检测作为采血血样的常规筛查技术,可最大限度的保障临床用血安全。 NAT 检测目前正在我国十五个省份推广使用,因此增加NAT 筛查血液对减少输血相关传播病感染的风险有重大意义。



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